单细胞技术｜免疫组库分析：单细胞BCR测序与单细胞转录组测序，揭示流感病毒感染后B细胞的时空变化

甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)是一种高度流行的呼吸道病毒，在人群中有较高的发病率和死亡率。当生物被甲型流感病毒感染后，病毒表面的糖蛋白—血球凝集素(hemagglutinin, HA)是B细胞的主要靶标，而且在肺部出现较多的记忆B细胞(memory B cells, Bmems)，关于肺部的记忆B细胞的功能和来源目前知之甚少。

序祯达单细胞测序技术平台能够提供单细胞基因表达定量、单细胞空间转录组、单细胞免疫组库(BCR/TCR)等多种类型的测序服务，且拥有10x Genomics和Singleron在内的多种单细胞测序平台。对于单细胞RNA测序数据的解读，序祯达更是积累了丰富的分析经验，能够为客户提供生物分子标志物寻找、高效抗体筛选、免疫细胞分化推断等个性化的分析服务。

下面与大家分享一篇Cell Reports上的文章：该研究以单细胞BCR测序与单细胞转录组测序为研究手段，在甲型流感病毒感染小鼠后的7天，14天，28天，分别取小鼠的纵隔淋巴结(mediastinal lymph nodes, MLN)，脾脏，肺三个脏器进行测序，揭示了流感病毒感染后B细胞的时空变化和肺部记忆B细胞的来源。

病毒感染后，B细胞将分化为不同类型的细胞

当病毒感染后，所有的B细胞(包括不同时间点的不同细胞)可以分成16个细胞群(图1A)，根据每个细胞群中高表达的基因，可以进一步将细胞群归类为特定的分化时期(图1B)。

进一步对16个细胞群按照脏器和病毒感染的时间进行分析，发现16个细胞群在不同的脏器中均有出现，但是处于同一病毒感染时间的不同脏器，细胞群所占的比例不同(图1CD)。在三个脏器中，肺部的记忆B细胞的比例较高，提示这些记忆B细胞可能来自其他的脏器。

图1: 病毒感染后，B细胞分化为16个细胞群

记忆B细胞来源于生发中心 (germinal center, GC) 中的B细胞

拟时序的分析显示，preGC C3s是早期的细胞群，preGC C3分化为earlyGC C14s，earlyGC C14s分化为不同状态的GCs。处于不同状态的GCs有一群细胞为preMem C9s，preMem C9s将分化为记忆B细胞，即Bmem C5s(图2A)。在基因表达模式上，preGC C3s，preMem C9s，Bmem C5s均有显著的变化(图2B)。

对Bmem C5s中的细胞进行聚类分析发现，肺部的记忆B细胞与其他脏器(纵隔淋巴结和脾脏)的记忆B细胞的表达模式不同(图2C)。

图2: 记忆B细胞来源于preMem C9s

纵隔淋巴结具有较多的扩张克隆

对三个不同的脏器的克隆扩张状态(clonal expansion status)进行分析，结果显示，纵隔淋巴结中75%以上的B细胞属于扩张克隆(expanded clonotypes)，而在脾脏和肺中，这个数值不到20%(图3A)。

根据特定的克隆拥有的细胞的数目，可以把克隆分成不同的类型，例如single (1 cell), small (between 1 and 5 cells), medium (between 6 and 20 cells), large (between 21 and 100 cells), and hyperexpanded (more than 101 cells)。按照不同的脏器不同的感染后的时间对细胞所属的克隆进行分析，结果显示，在纵隔淋巴结中，病毒感染后7天，即有medium expanded clones。感染后14天，即有large and hyperexpanded clones。感染后28天，大部分B细胞属于hyperexpanded clones。而在脾脏和肺中，大部分克隆是如single and medium clones(图3B)。

这些结果说明克隆扩张是由脏器类型决定的。

图3: 不同的脏器，B细胞的克隆扩张能力不同

记忆B细胞的前体细胞分化为记忆细胞 与前体细胞对血球凝集素的亲和力无关

有观点认为，位于生发中心的记忆B细胞的前体细胞最终分化为记忆B细胞(Bmem)还是浆母细胞(plasmablast, PB)，是由前体细胞对血球凝集素的亲和力高低决定的。亲和力高，分化为浆母细胞；亲和力低，分化为记忆B细胞。在本文中，作者选取了23个具有代表性的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)，其中13个来自记忆B细胞，10个来自浆母细胞。然后利用生物膜层干涉(Biolayer interferometry, BLI)测定细胞与血球凝集素间的亲和力。发现记忆B细胞和浆母细胞键的亲和力并没有显著差别，但是来自不同克隆的细胞与血球凝集素间的亲和力有显著差别(图4)。这个结果说明，不但与血球凝集素亲和力低的记忆B细胞的前体细胞可以分化为记忆B细胞，与血球凝集素亲和力高的记忆B细胞的前体细胞也可以分化为记忆B细胞。

图4: 记忆B细胞的前体细胞与血球凝集素的亲和力不影响前体细胞的分化

小结

本文以小鼠感染流感病毒为模型，研究了小鼠不同脏器的基因表达模式和BCR的分布特征，以此我们可以得出肺部的记忆B细胞来源于纵隔淋巴结和脾脏处的记忆B细胞的前体细胞，以及记忆B细胞的前体细胞与血球凝集素亲和力的高低与记忆B细胞的前体细胞是否能分化为记忆B细胞无关(图5)的研究结论。

图5：肺部的记忆B细胞来源于纵隔淋巴结和脾脏处记忆B细胞的前体细胞

参考文献：

Mathew et.al, Single-cell BCR and transcriptome analysis after influenza infection reveals spatiotemporal dynamics of antigen-specific B cells, Cell Rep, 2021, doi: 10.1016/j.celrep.2021.109286.

Quiroz et.al, Role of inducible bronchus associated lymphoid tissue (iBALT) in respiratory immunity, Nat Med, 2004, doi: 10.1038/nm1091.

Suan et.al, CCR6 Defines Memory B Cell Precursors in Mouse and Human Germinal Centers, Revealing Light-Zone Location and Predominant Low Antigen Affinity, Immunity, 2017, doi: 10.1016/j.immuni.2017.11.022.