最小成本覆盖最多致病性变异,序祯达全外显子测序助力遗传病检测

随着时代的进步和技术的突破,测序技术(NGS)为遗传病从分子、基因水平进行深入研究提供了预防、诊断的“利器”。其中,全外显子组测序(WES)技术作为主要的基因检测手段,在临床上更是获得了广泛的关注,成为临床诊断遗传病及有效发现致病变异的一种非常高效的手段。序祯达全外显子组检测服务可一次性检测人类基因组中约20,000个与疾病相关的候选基因,涉及4000多种单基因遗传病,全方位满足单基因遗传病精确诊断的临床和科研需求。

全外显子测序遗传性诊断简史

自从1970年代开始,多位科学家如Walter Fiers、Fredrick Sanger、Maxam and Gilbert等人设计了多种测序的方法开创了最早的测序方法学的序幕。其中,Fredrick Sanger所采用的方式为利用DNA聚合酶(DNApolymerase)复制DNA片段外加以混合同位素标定的不同ddNTP来随机终止DNA片段延伸的方式,完成了大肠杆菌噬菌体PhiX174的基因组序列(为5386bp的环状DNA)的测序。

这种方式是基于聚合酶链式反应的原理来复制并标定大小不一的DNA片段后通过电泳胶图来解析这些随机复制但大小不一的DNA片段。由于每个片段在被同位素所标定,因此可通过每个反应中所加入的ddNTP(ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)的类型来读出所标定片段最3端的核苷酸类型来排列出DNA片段的序列。这个方法被命名为桑格测序法(Sanger sequencing)或双脱氧链终止法【图1】,并由Fritz Pohl最早设计出此测序法的第一个测序平台后,逐步发展出后来的测序自动化流程,奠定了测序自动化的基础,使得早期遗传病研究得以开展。

直到1996年后,在基于桑格测序中的聚合酶链反应原理基础上,Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen and Pȧl Nyŕen等科学家发展出焦磷酸测序(pyrosequencing)的方式,通过核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放来确定DNA中核苷酸的顺序,这个方法使得DNA的复制与序列排序的步奏得以同步,且此技术被认为是二代测序发展的开端,并使得高通量测序成为可能【图1】。

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图1:一代测序与二代测序的原理2

而近几十年对于编码蛋白基因的功能研究较为完善,因此二代测序(Next Generation Sequencing)的全外显子测序成为了遗传病检测的主流,且相比于过往以芯片为主的部分遗传检测仅限于特定位点来检测遗传病来比较,利用全外显子测序技术来检测点突(SNV)或部分CNV有覆盖更广且提高检测阳性率的优势。

全外显子测序特性 与覆盖范围所体现的优势

由于临床样本的收集过程中可能经历多人之手,且在临床端收集检测样本时,往往因为要作为多个检测项目的样本来源,使得样本可能出现多次分装取样的情况。因此,无论是何种来源的DNA样本,多少会出现DNA降解的可能性,这使得部分以长片段为模版的一代测序方法学收到了检测的限制。

然而针对高通量的全外显子测序,目前主要是通过二代测序方法学中的所产生的150bp的读长来匹配基因组参考序列后拼装出的DNA序列。即使DNA本身有部分的降解,也能基于拼装出来的DNA序列把大多数基因的编码区(CDS)及周围的序列定义出来,并且通过深度及所拼装出的序列中SNP的组合比例来检测出可能导致遗传病的致病性变异。

相比于早期以一代测序或芯片为主的遗传检测,高通量全外显子测序对于大部分外显子区域附近的点突、小片段的缺失、重复或插入等SNV有较高的覆盖率,且对于许多基因的主要拷贝数变异的图谱解析也具有一定的敏感性。

另外,由于全外所需测序的覆盖区域,仅占全基因组序列的2-3%。截至目前为止,大多数遗传病患者的致病性图变主要与全外覆盖区为主,若有已知的少数的深内含子区域位点,也可通过添加该区域的探针的方式来使非外显子或附近区域的覆盖率提升来提高检测阳性率。全外显子测序在目前的临床辅助诊断中,既能符合覆盖多数基因的已知致病性突变,也因为所需测序范围比全基因组测序来得小,而使得在利用全外显子检测的经济效益上有一定的优势。

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图2:全外显子测序的特点与优势3

全外显子测序在 检测地中海型贫血的应用

下面我们来看一个实例,在中国人群中地中海型贫血为常见的遗传病类型,在我国南方地区中发病率影响最大的遗传病之一,在我国尤其以两广及台湾省的部分地区与人群有超过百分之5以上的致病变异携带率,该疾病基于突变所在的基因可区分为甲型地中海贫血(以HBA1/HBA2的点突或小片段缺失重复或大片段缺失为主为主)及乙型地中海型贫血(HBB基因的致病性SNV为主)2种主要的疾病类型4,过去由于有部分突变类型为地贫患者身上常发现的致病性变异(如HBA1/HBA2的5种拷贝数变异缺失或SNV及部分HBB点突)。因此有针对这些特定突变变所设计的基因检测方法被用在快速遗传诊断,然而对于较少出现的突变位点则无法通过此法找到对应的变异。

全外显子显子测序针对地中海贫血的HBA1、HBA2及HBB基因的覆盖率可做到针对HBA1/HBA2基因的全覆盖以及覆盖到HBB的深内含子区域,覆盖了99%以上的致病性位点分布区间,通过适当的生信分析流程,可以把致病性SNV及CVN(拷贝数变异)可以分析出来【图3】,可以有效的提升在地中海贫血病遗传病基因因检测的阳性率5,同时也可同步检测其他与遗传病有关的基因突变,使得遗传检测可以在成本与检测效率之间取得一个合理的平衡。

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图3:地中海型贫血相关基因在全外显测序的覆盖情况

由于近几十年来分子生物学中心理论的基础,使得基因组中存在的变异来推测对各自编码蛋白的影响成为可能,全外显子测序的设计很好的提供了检测出基因组中对编码蛋白有影响的变异。目前多数的科研证据中,主要的致病性变异都分布在全外显子测序的范围内,因此针对许多遗传病患者的遗传病因检测可适用于全外测序,且相对成本来说也在可承担的范围内。

当然,部分遗传病的病因(如3核苷酸动态突变或多数的结构变异)在现有的技术还无法通过全外显子测序中检出,因此针对全外显子测序的设计也有待未来的技术更迭提升,进一步提高遗传检测的阳性率。

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明日6月22日(周三)下午14:00,序祯达直播间将聚焦全外显子组测序技术,邀请医学专家黄国翔博士与大家分享《全外显子组测序辅助遗传病分子研究》,想要了解更多遗传病检测技术干货可点击下方链接预约报名观看。

参考文献:

1.Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016;107(1):1-8. doi:10.1016/j.ygeno.2015.11.003

2.Bunnik EM, Le Roch KG. An Introduction to Functional Genomics and Systems Biology. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013 Nov;2(9):490-498.

3.Cortini F, Marinelli B, Pesatori AC, Seia M, Seresini A, Giannone V, et al. Clinical Application of NGS Tools in the Diagnosis of Collagenopathies. Explor Res Hypothesis Med. 2017;2(3):57-62.

4.https://www.cdc.gov/ncbddd/thalassemia/facts.html

5.Steinberg-Shemer O, Ulirsch JC, Noy-Lotan S, et al. Whole-exome sequencing identifies an α-globin cluster triplication resulting in increased clinical severity of β-thalassemia. Cold Spring Harb Mol Case Stud. 2017;3(6):a001941. Published 2017 Nov 21. doi:10.1101/mcs.a001941

 

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基因科技基因科技管理团队
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