免疫组库分析（三）：单细胞测序揭示乳腺癌BCR多样性与免疫治疗响应关系

写在最前：肿瘤免疫疗法的出现极大地提高了肿瘤患者的生存周期，但在临床表现上，并非所有的肿瘤患者都对免疫治疗有响应，如何提高免疫治疗效率是现在亟待解决的问题。序祯达目前已建立完善的转录组和免疫组库分析平台，可为客户提供从临床前PBMC细胞和小鼠模型到临床样本的各类型人/鼠TCR/BCR全长测序和分析服务。利用序祯达成熟的多样化的单细胞平台，还可以进行单细胞层面的免疫组库和转录组多组学研究分析。

本篇研究中，研究者在单细胞水平系统性地描绘了乳腺癌浸润B细胞图谱。通过B细胞受体（BCR）序列分析揭示肿瘤中浸润B细胞可能来自于原位memoryB细胞与肿瘤抗原接触后的不断分化，发现肿瘤浸润B细胞与乳腺癌患者的预后存在很好的正相关性。

图：结合单细胞测序和BCR分析

来描绘乳腺癌肿瘤浸润的B淋巴细胞图谱

B细胞作为免疫系统的重要组分之一，通过分泌抗体，细胞因子，趋化因子或呈递抗原等途径行使功能，但其在肿瘤发生过程中所扮演的角色在不同研究中存在争议，这与它们的表型、抗体亚型和产生、定位以及肿瘤类型和肿瘤微环境(TME)等均有关系。以乳腺癌为例，当利用B细胞的经典标记物CD20来评估肿瘤浸润B细胞与患者预后的关系的时候，在不同研究中可能得到互相矛盾的结论。造成这种争议的一个可能原因是不同乳腺癌病人肿瘤浸润B细胞亚群存在区别，而不同B细胞亚群可能行使不同功能。

淋巴细胞的分布

在不同患者中呈异质性

图：人乳腺癌患者免疫细胞的异质性

研究者利用单细胞转录组测序结合单细胞BCR测序分析了10例乳腺癌病人的肿瘤浸润免疫细胞，并用相应的外周血来源的免疫细胞作为对照。10例病人中有6例是三阴性乳腺癌（TNBC），3例Luminal-A乳腺癌(LABC)和1例HER2乳腺癌(HER2BC)。结果聚成四类细胞簇，包括T细胞(CD3D)，B细胞(CD20)，NK细胞(NKG7)和巨噬细胞/单核细胞/中性粒细胞(CD14)。不同淋巴细胞簇的分布在不同患者之间是呈异质性的。例如，肿瘤样本中B细胞占4.6%~ 50.5%（平均为22.1%），T细胞占21.4~ 73.7%(平均46.2%)，NK细胞占0.5~ 5%(平均2.6%)。

肿瘤浸润B细胞以更多的体细胞高频突变

和更高的B细胞克隆性为特征

图：单细胞BCR分析TNBC患者肿瘤和外周血样本中IGH克隆多样性分析

利用10xGenomics单细胞RNA(5’)+V(D)Jchromium平台研究B细胞和T细胞抗原受体位点的重排状态。结果显示，肿瘤和PBMC样本之间的VH、DH或JH基因使用没有显著差异。然而，外周血B细胞中germlineBCR比例更高，IgM和IgD比例也相对更高，而在肿瘤浸润B细胞中，检测到更多的体细胞高频突变（somatichyper mutation, SHM）和更高的B细胞克隆性。

图：TNBC患者B细胞转录组和IGH分析图谱（low resolution）

经过分析TNBC中浸润B细胞的细胞多样性，发现B细胞可分为四类：naïveB细胞（IgM+和IgD+），memoryB 细胞（CD27+），plasmaB 细胞（CD38+）和CD14+B细胞（CD14+），其中肿瘤浸润B细胞主要为memoryB细胞。肿瘤中浸润B细胞极有可能是由原位memoryB细胞不断分化而来。

图：TNBC患者B细胞转录组和IGH分析图谱（high resolution）

进一步探究B细胞组分，可将B细胞分为13个簇：naïveB cells (C1和C2),IgM+CD27+ memory B cells (C3, C4, C6和C7),IgM+CD27- atypical memory B cells (C5), class-switched memory B cells(C8,C9, and C10), plasma cells (C11), germinal center B cells (C12) 和CD14+atypical B cells (C13)。并且通过免疫组化证实了GerminalcenterB细胞和肿瘤浸润淋巴结结构的存在。在乳腺癌浸润B细胞中，并未检测到分泌IL10的调节性B细胞Breg。通过GSEA分析，发现肿瘤浸润B细胞可能主要通过呈递抗原或分泌抗体的形式行使功能。

肿瘤浸润B细胞丰度

与TNBC患者的预后存在正相关性

图：TNBC患者B细胞marker生存曲线

分析METABRICconsortium TNBC患者的表达数据和临床信息，发现naiveB细胞和memoryB细胞的marker与TNBC患者的总生存期（OS）和无病生存期(DFS)的提高显著相关(p<0.05)。且与经典的B细胞markerCD20相比，拥有更好的预后。

总结

免疫微环境在肿瘤的发生和治疗中起着重要作用。其中，肿瘤浸润B淋巴细胞（TIL-B）与预后好坏密切相关，如卵巢癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌和肾细胞癌等。研究者通过单细胞转录组及BCR免疫组库测序系统性地描绘了乳腺癌浸润B细胞图谱，揭示肿瘤浸润B细胞可能来自于原位memoryB细胞与肿瘤抗原接触后的不断分化，发现肿瘤浸润B细胞与TNBC患者的预后存在很好的正相关性。B细胞是如何浸润肿瘤，以及在肿瘤微环境中如何增殖分化可为肿瘤的治疗提供新思路。

参考文献：

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