免疫炎症蛋白组学在新冠肺炎及细胞治疗前沿应用

免疫治疗作为当前热门治疗手段，其研究关注的细胞因子可阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。2021年9月8日，序祯达生物科技发起“Olink免疫炎症蛋白组学在新冠肺炎及细胞治疗前沿应用”线上直播课，邀请到Olink Proteomics钟申丽老师担任序祯达直播间的主讲嘉宾，全程持续一个多小时，与观众分享多重细胞因子检测平台研究成果及心得，并详细解析了细胞因子免疫疗法的发展方向及展望。

什么是细胞因子？

细胞因子是由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。是一种具有广泛调节细胞功能作用的多肽分子，不仅作用于免疫系统和造血系统，还广泛作用于神经、内分泌系统，对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

免疫炎症蛋白组学谋篇布局

直播中钟申丽老师提到，“细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，已被广泛用于疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等。不同于抗体药物，细胞因子的受体较多且功能复杂，往往需要深入的机制研究。”她着重指出，“Olink提供的Inflammation Panel 是一种高通量、多重免疫测定Panel，仅需1µL样本即可高质量完成近百种细胞因子检测。“

她通过讲解《COVID-19儿童感染者多系统炎症综合症的免疫学研究》、《针对小儿多系统炎症综合症全身性炎症和抗体响应的研究》等多个具体应用案例，以及评估不同临床患者在免疫系统应答水平的差异，阐述细胞因子在免疫细胞的发育分化、免疫应答及免疫调节过程中的重要作用。细胞因子还被应用于临床的生物学治疗，具有深远的意义，目前已有5项采用了Olink PEA技术的COVID-19相关临床试验正在进行中，这些临床试验将为新冠肺炎及其并发症治疗带来新曙光。

观众问题集锦回顾

以下整理了六个方向的13个问题及答案：

一、应用领域问题

问1

能讲讲怎么和其他组学联用分析吗？比如说神经panel与神经退行性疾病是因果关系，还是类似有差异性的呢？

答1

简而言之，Olink第一次克服了蛋白组的数据质量问题，从而使多组学联用最终得以落地（疾病表型+基因组+蛋白组，三者通过孟德尔随机化等算法，形成因果链）。我们在后续讲座中都会有蛋白组学、基因组学、转录组学和代谢组学等多组学案例分享，如9月23日神经生物学专题、10月20号pQTL多组学专题等。神经Panel与神经退行性疾病的研究，会在9月23日单博士主讲的阿兹海默症日专题中有详细案例分享，敬请关注。

问2

Olink蛋白组学是主要测细胞因子吗？

答2

Olink蛋白组学非常好地覆盖了细胞因子，但不局限于细胞因子。Olink蛋白组学针对不同的疾病类型，以Target 96 panel为例，分别用来检测心血管代谢、心血管、发育、免疫反应、肿瘤免疫、炎症、代谢、神经系统疾病、肿瘤、器官损伤、小鼠样本等不同应用场景。

问3

能选择部分因子进行检测么？

答3

我们可以根据前期检测数据结果和客户具体需求，提供定制化产品服务。

二、技术原理问题

问4

互补的一对寡核苷酸单链会不会不跟抗原结合，自己也形成双链，造成假阳性？

答4

Olink 邻近延伸反应(Proximity Extension Assay, PEA)技术的核心是互补的每一对寡核苷酸单链(探针)，只有在其偶联的抗体对特异性结合抗原蛋白时才形成双链并进行PCR扩增反应。同时每个assay的互补寡核苷酸探针都设置了阴性对照，如果在反应中有高背景值或环境污染引起的假阳性信号，均会在数据质控过程中反映出来并有警示。

问5

这么多个标志物同时检测是否会有交叉干扰？

答5

Olink多重标志物的检测特异性是其PEA邻近延伸反应的技术核心，每一个panel中的单个以及多重指标的特异性信号均经过严格的验证，并且方法学内容完全公开透明。更进一步的是，我们还做了对具有高度相似序列的同源蛋白之间的交叉反应检测，结果显示了极低的干扰程度0.1%。

问6

相当于双抗夹心的方法吗？3702种标志物是否需要7404种抗体？有标准品吗？

答6

PEA技术中有一对特性性抗体同时识别抗原，类似双抗夹心法。但不同的是，PEA技术是均相检测，不需要固相包被的捕获抗体，一对抗体同时识别抗原后DNA单链互补结合，增加检测的特异性和灵敏度。3702种标志物检测对应有优化验证过的3072对抗体，或者用您的话说7404种抗体；但他们是作为成品试剂盒出售的，所以您不需要额外采购任何抗体。试剂盒出厂前有严格的用于质控的标准品和对照。

问7

血浆检测前需要与固相板包被吗？这样后面清洗能去除非特异结合？

答7

PEA的检测方法是基于一对抗体特异性识别抗原的均相检测，不需要固相板包被（参考答6），所以不需要任何清洗步骤去除非特异结合。

三、种属兼容性问题

问8

可以做小鼠/大鼠或者猴子的样品吗？

答8

我们有专门做鼠源生物标志检测Target 96 Panel。我们所有用于人源检测的Panel都可以用于猴子样品的检测。除了前面提到的人、猴和鼠源样品以外，测试过的动物还有狗 、猫 、猪 、猴 、牛 、熊、马等。

问9

用于猴子的检出率怎么样？

答9

已测试过不同的非人灵长类 (NHP) 样品，其检出率接近于人类样品。结果主要基于猕猴Rhesus 与 食蟹猴Cynomolgus （旧大陆猴 old world monkeys）。

四、样品处理问题

问10

除了血液，可适用于其他的样本类型吗？在PCR反应之前，需要对血液进行预处理吗？

答10

Olink panels 广泛适用于血清、各种血浆、组织裂解液、细胞培养液、脑脊液、细胞培养液、血小板提取液、尿液、细胞裂解液、微泡/外泌体、组织液、微透析液、细针活检组织样本、干血斑、滑液、唾液、眼睛房水等。

如果是血浆和血清样品，则不需要进行预处理便可以直接分析。由于蛋白质可能会受到与样品收集和存储有关的多种因素的影响，因此样品准备程序的标准化很重要，Olink提供各种样本的处理方法建议文档。虽然大量的非标样品类型与PEA技术相兼容，但为了获得准确可靠的结果，确定每个特定基质的性能是很重要的。

问11

脑脊液或者唾液样本等其他体液检测前是否需要稀释？是否和血液样本一样检测前不需要其他处理？

答11

对血清和血浆样本，Olink进行了充分的优化与验证，这意味着各个指标的动态范围已经调整到血清和血浆中预期的蛋白浓度。由于不同样本类型的蛋白组成不同，通常进行预实验可以确保您在最佳条件下分析样本，指导样品稀释，以确保数据在分析的动态线性范围内，以及是否存在任何有过饱和的风险。

四、配套设备及软件问题

问12

NGS的数据怎么分析呢？有配套的分析软件么？

答12

Olink提供免费在线数据分析应用 Olink Insights Stat Analysis，它整合了Olink开发的R数据分析包功能，您可以通过提交实验数据（或者网站上的DEMO）进行多种分析，如分析样本间NPX values分布图，生成Principal Component Analysis (PCA) plots，生成Heatmap， 进行基本统计分析与作图（e.g. t-test or Analysis of Variance）和提供数据与图表下载（以及其它更多的分析选项）

五、技术对比问题

问13

Olink 蛋白组学研究和现在比较成熟的蛋白组学方法，如质谱MS相比有什么区别呢？

答13

Olink Explore 1536 产品与质谱 (Mass Spec)的技术特点比较概述如下图：

传统意义上，质谱MS蛋白组方法被认为是「无偏的」，但因受限于检测灵敏度，质谱MS蛋白组方法在检测血浆等体液样本时，会无可避免地漏掉低丰度蛋白，尤其是一些有重要生物学意义的蛋白标志物。所以，从生物学角度来看，质谱MS蛋白组方法在血浆样本检测时，实际上是「有偏的」。

靶向蛋白组方法被认为是「有偏的」，因为无法全面覆盖样本中有生物学意义的所有蛋白，但Olink 最新发布的Explore 3072产品的出现改变了这一状况。Explore 3072一方面借助其高灵敏度，将血浆中蛋白检出的数量从1500个左右（质谱MS的普遍瓶颈）提升到了3000多个蛋白；另一方面，也更重要的是，这3000多个目标蛋白标志物，覆盖了100%的主要生物学信号通路。所以，Olink超灵敏血浆蛋白质组，第一次真正实现了生物学意义上的「无偏」。