CRISPR靶向捕获结合长读长测序技术全面揭示乳腺癌致病机理

华盛顿大学著名学者Mary-Claire King及其团队学者在《Journal of Medical Genetics》发表题为“CRISPR–Cas9/long-read sequencing approach to identify cryptic mutations in BRCA1 and other tumour suppressor genes”¹的研究论文，该研究将长读长PacBio HiFi测序技术与CRISPR-Cas9靶向技术相结合，清晰呈现了复杂非编码区域的变异，为寻找致病变异提供全面的信息，揭示乳腺癌BRCA1基因中新的生物学相关突变。

基于基因序列结构的复杂性，以及现有技术的局限依然难以精准确认乳腺癌中基因的致病变异。序祯达生物现搭建全方位的长、短读长测序分析平台，通过单独应用长读长测序或与更准确的短读长测序相结合，能够对单等位基因分辨率进行基因组突变鉴定。这种模式下的广泛分析超出了传统测序技术限制，使研究人员能够在前所未有的分辨率，解锁先前隐藏的变异，为抗癌药物开发及临床提供更精准的证据。

揭示BRCA引发乳腺癌关键致病变异

针对应用于乳腺癌诊断BRCA1和BRCA2基因中变异的检测，已经开发了多种基于外显子及内含子侧翼的捕获的短读长测序技术试剂盒，但当BRAC1基因发生倒位或移动原件插入等复杂结构变异时，此类试剂盒仍无法将其精确检测出来。

BRCA1基因所在的基因组区域，包含了42%的Alu重复，并且在启动子和前两个外显子之间分布了约30 kb的串联重复。对于短读长测序技术来说，这样的结构非常棘手。在Mary-Claire King的这项研究中，选择了19个有早发乳腺癌史家系的个体，这些个体在过去都使用过全外显子测序技术，基因panel等手段进行了检测和分析，但均没有发现有关早期乳腺癌易感性的致病性突变。

为了靶向BRCA1和BRCA2两个基因，并且为了避免GC富集区域导致的PCR富集困难，研究小组使用了Sage Science基于HLS-CATCH CRISPR的靶向方法，富集了长达200 kb的目的片段高分子量DNA，后续采用长读长PacBio HiFi技术在Sequel系统上进行测序。平均测序片段长度约为10,000 bp，可以完全覆盖两个BRCA位点，并包含非编码元件。长读长测序的优势在于其适用于阐明等位基因突变状态和复杂癌症基因组的完整结构。

通过这一靶向方案结合高准确度的长读长PacBio HiFi测序，研究人员在内含子中发现了一个由SINE-VNTR-Alu（SVA）逆转座子构成的2,856 bp的插入，可在BRCA1的转录中产生假外显子，引起过早的截断。而这一插入变异在过去的数据中，甚至是最新采用长读长测序技术进行结构变异的分析中3，都从未被报道过。

这一2,856 bp的SVA插入位于17号染色体，BRCA1基因的13号内含子上。同时，研究人员们也发现，它与1号染色体上的一个相应区域，有着98.6%的序列相似。

而PacBio长读长多次读取的HiFi技术，在序列读取方面能够对野生型中内含子侧翼序列及所有的变异元件进行更为精确的检测，从而更加清晰的呈现了相关变异。

基于这一发现，作者也提到，“或许还有更多的致病性复杂结构变异”，“复杂的突变很可能在肿瘤抑制基因上很常见，但目前我们往往受限于现有的检测方法而难以洞察。”PacBio HiFi测序，结合CRISPR–Cas9靶向捕获技术则能够有效的检测各种复杂非编码的结构变异。

为了对华盛顿大学医学和基因组科学系的科学家Mary-Claire King在人类基因组研究方面做出的巨大贡献表示感谢，美国人类遗传协会向Mary-Claire King女士颁发了威廉·艾伦奖。Mary-Claire King是乳腺癌相关重要基因BRCA1和BRCA2的发现者，也是乳腺癌研究的一位传奇人物。

参考文献：

1.Walsh, Tom, et al. “CRISPR–Cas9/long-read sequencing approach to identify cryptic mutations in BRCA1 and other tumour suppressor genes.” Journal of Medical Genetics (2020).

2.https://sagescience.com/wp-content/uploads/2020/03/AGBT-202-POSTER-BO-ZHOU.pdf

3.Audano, Peter A., et al. “Characterizing the major structural variant alleles of the human genome.” Cell 176.3 (2019): 663-675.