单细胞技术｜单细胞DNA&Protein多组学分析加速血液肿瘤临床转化研究

肿瘤细胞存在高度异质性，同一病灶可包含多个携带不同突变的克隆，靶向治疗通常对携带某个突变的恶性细胞进行杀伤，但肿瘤细胞克隆结构的不断变化，影响了靶向治疗疗效，甚至导致耐药和复发。

序祯达生物助力解析肿瘤克隆进化、耐药复发机制研究

过去，我们通过bulk DNA测序进行肿瘤异质性研究，根据等位基因频率（VAF）进行克隆组成和克隆进化的推断1。但是VAF 仅能反映平均突变频率，掩盖了异质性，得出模糊或不准确的结果，同时VAF还受到肿瘤纯度的影响，进一步影响结果的准确性2。如果我们能在单细胞尺度上获得肿瘤细胞的突变信息，便可对克隆结构进行直接测定。序祯达生物单细胞平台中的重要成员之一，Mission Bio单细胞DNA测序平台可对单细胞样本进行高通量、高灵敏度、以及多组学层面上的分析检测，检测含量低至0.1%的罕见亚克隆，有助于发现突变的合子型和突变共发生情况。

序祯达生物作为国内首家获得Mission Bio PAD（Pharma Assay Development）认证的服务商，拥有符合CLIA/CAP/ISO15189/ISO27001标准的专业检测能力，结合基因组学、转录组学、蛋白质组学、微生物组学多组学整合解决方案经验，可为药企客户提供从实验设计、Panel定制、单细胞 DNA实验、数据分析、结果解读的全流程服务方案，助力血液肿瘤克隆进化结构解析、耐药复发机制等研究。

单细胞DNA测序为血液肿瘤开辟新途径

单细胞 DNA测序使用微流控系统在微小的反应体系中对单个细胞进行封装、裂解、靶向扩增，构建单细胞文库（图1），通过二代测序可一次性对5000-10000个细胞进行最多1000个基因组区域的检测，从而获得可靠的肿瘤克隆结构以及克隆进化信息。更进一步，在细胞封装前使用barcode 标记的抗体与细胞进行孵育，可同时获得表面蛋白的半定量信息，结合基因型（DNA）和细胞表型(Protein)的信息更有利于揭示肿瘤的异质性。

图1. Mission Bio单细胞Tapestri平台实验原理与流程

图2. 单细胞 DNA&Protein技术特点

在肿瘤研究中，血液肿瘤具有样本可及性高、突变图谱较窄等特点，已经有大量利用单细胞DNA&Protein测序进行转化医学研究的成功案例，以下几个典型案例利用单细胞DNA或者单细胞DNA联合表面蛋白的技术揭示了血液肿瘤的克隆结构和进化情况，帮助人们理解肿瘤发生、耐药、复发等内在机制。

01 单细胞DNA分析发现驱动复发的多克隆结构

来自的美国宾夕法尼亚大学的研究人员3，通过单细胞分析Gilteritinib（吉列替尼）治疗后AML患者体内肿瘤细胞克隆的变化，找到了通过传统bulk测序较难发现的耐药克隆。该研究中，单细胞 DNA测序（图3）不仅检测到了药物敏感的IDH2/SF3B1/FLT3三突变克隆（蓝色）以及获得性的 RAS 四突变耐药克隆（红色）。更重要的是，还检测到了在诊断时期就出现的IDH2/SF3B1的双突变克隆（绿色），该克隆在复发阶段发生了增殖，该克隆对 FLT3抑制剂不敏感。通过单细胞DNA 测序可在该病例诊断时揭示其耐药的结局。

图3. 单细胞DNA分析发现AML病例的复杂结构耐药克隆

02 单细胞DNA对共突变、突变合子性进行确认

SDS 是一种遗传性骨髓衰竭综合征，SDS 患者患白血病风险增加。来自美国丹娜-法伯癌症研究所的研究人员4通过Bulk 测序发现 TP53和EIF6不仅突变频率高，且在同一个病人出现，提示两个突变可能共发生并在功能上具有一定关联。但进一步单细胞 DNA 测序发现TP53和 EIF6并不在同一个细胞和克隆中同时出现，推翻了 bulk 测序得到的假设。

图4. 单细胞 DNA 测序准确判断共突变

研究人员进一步研究发展为白血病的SDS患者的突变图谱，单细胞测序可发现稀有克隆细胞群中TP53的等位基因不平衡。TP53 C242F突变联合TP53 LOH 事件导致了SDS 向白血病的转化，通过单细胞测序发现的这些罕见克隆的出现早于白血病发生4.5年（图5）,解释了从 SDS 向白血病转化的机制。

图5. 单细胞 DNA 测序可准确判断合子性

03 单细胞DNA结合表面蛋白获得特殊耐药克隆

来自UCSF的研究人员对AML使用单细胞DNA&Protein方法进行长期追踪研究5，包括对诊断、缓解、复发、FLT3抑制剂治疗的四个阶段进行采样。研究一共发现了3类恶性细胞（blast 1~3, CD33和 CD38阳性）以及3类正常细胞（图6）。该病例复发后出现了 DNMT3Amut/NPM1mut/FLT3-ITDmut基因型的细胞群（即Blast2），使用FLT3抑制剂治疗后， Blast2恶性细胞群消失，但诱导产生了红细胞样的恶性细胞群（Enythroid, CD71阳性），该细胞群和 blast2细胞群基因型相同，仅可通过表面蛋白进行区分和鉴定。

图6. 单细胞表面蛋白进行细胞分型

图7. 单细胞DNA&Protein 联合分析鉴定出相同基因型不同细胞表型的恶性细胞

大量研究表明，细胞异质性、克隆多样性等是影响肿瘤耐药和癌症复发的关键因素。未来，通过以上技术平台的广泛应用，单细胞技术依旧会作为挖掘生物现象的有力工具，我们可以相信，在不久的未来，更为成熟的策略发展将会出现在世人眼前，单细胞DNA&Protein测序这类常见方法将被应用到更多的疾病发生机理的探究中。

参考文献：

1. Jamal-Hanjani, Mariam et al. “Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer.” The New England journal of medicine vol. 376,22 (2017): 2109-2121. doi:10.1056/NEJMoa1616288

2. Schwartz, Russell, and Alejandro A Schäffer. “The evolution of tumour phylogenetics: principles and practice.” Nature reviews. Genetics vol. 18,4 (2017): 213-229. doi:10.1038/nrg.2016.170

3. McMahon, Christine M et al. “Clonal Selection with RAS Pathway Activation Mediates Secondary Clinical Resistance to Selective FLT3 Inhibition in Acute Myeloid Leukemia.” Cancer discovery vol. 9,8 (2019): 1050-1063. doi:10.1158/2159-8290.CD-18-1453

4. Kennedy, Alyssa L et al. “Distinct genetic pathways define pre-malignant versus compensatory clonal hematopoiesis in Shwachman-Diamond syndrome.” Nature communications vol. 12,1 1334. 26 Feb. 2021, doi:10.1038/s41467-021-21588-4

5. Demaree, Benjamin et al. “Joint profiling of DNA and proteins in single cells to dissect genotype-phenotype associations in leukemia.” Nature communications vol. 12,1 1583. 11 Mar. 2021, doi:10.1038/s41467-021-21810-3